| La technique quantitative de réaction en chaîne par polymérase en temps réel (qPCR) est largement utilisée à des fins scientifiques, cliniques, diagnostiques ou de contrôle qualité. Les applications de la qPCR comprennent l’analyse de l’expression génique, la détection de mutations, le génotypage, la détection d’ADN et la quantification (comme les agents pathogènes). |  |
| Bien que les sondes fluorescentes Taqman confèrent une spécificité et une sensibilité élevées aux tests, la détection non spécifique basée sur des colorants se liant à l’ADN (c’est-à-dire EvaGreen®, SYBR® Green I) offre une grande polyvalence aux tests qPCR. Malgré leur large utilisation et leurs bonnes performances, les colorants se liant à l’ADN utilisés présentent dans certains cas un problème de sécurité (les colorants se liants à l’ADN sont mutagènes). Cet article décrit pourquoi l’EvaGreen® surmonte ces inconvéniants par rapport au SYBR® Green I. Et comment l’Evagreen® conserve l’avantage sur les sondes TaqmanTM dans de nombreuses applications. Enfin, certains colorants permettent à la qPCR de déterminer la viabilité des micro-organismes ! | |
1. Quelle est la différence entre EvaGreen® et SYBR® Green ?
Le colorant EvaGreen® est spectralement similaire au FAM ou SYBR® Green I, ce qui signifie qu’aucune modification des paramètres optiques n’est requise pour l’utilisation d’un master mix à base d’EvaGreen®. Cependant, il existe plusieurs différences entre les colorants.
a. Principe unique :
Le colorant EvaGreen® fonctionne par un nouveau mécanisme de “libération à la demande” :
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| EvaGreen® Forme inactive | EvaGreen® Forme active | Complexe EvaGreen-ADN |
Le colorant EvaGreen® se lie à l’ADNdb via un nouveau mécanisme de “libération à la demande”.
b. Plus sûr :
| Le colorant EvaGreen® est le premier et le seul colorant PCR à ce jour conçu pour être sûr et sans danger pour l’environnement. |  |
| Des laboratoires indépendants ont confirmé que le colorant EvaGreen® est non mutagène, non cytotoxique et sans danger pour la vie aquatique lors d’une élimination directe dans l’évier. D’autres colorants PCR commerciaux entrent dans les cellules en quelques minutes, contrairement à Evagreen®. Le SYBR® Green I, par exemple, s’est même révélé plus toxique pour l’environnement que le bromure d’éthidium, un mutagène bien connu [Ohta T.]. Pour plus de détails, téléchargez le Rapport sur la sécurité de l’EvaGreen®. | |
c. Bruit de fond plus faible :Le colorant EvaGreen® a moins de bruit de fond que SYBR® Green I en raison de son nouveau mécanisme de liaison à l’ADN avec “libération à la demande”. d. Plus brillant et non inhibiteur :l’EvaGreen® est moins inhibiteur de la réaction PCR que SYBR® Green, permettant l’utilisation d’une concentration de colorant à saturation pour un signal maximal et une meilleure analyse de la courbe de fusion de l’ADN en haute résolution. |
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e. Stabilité du colorant
le colorant EvaGreen® est très stable à la fois au stockage et dans des conditions de PCR [Nowaldy]. Le SYBR® Green I, quant à lui, est connu pour se dégrader après plusieurs cycles de gel-dégel et dans les conditions de PCR. De plus, le SYBR® Green I décomposé serait encore plus inhibiteur de la PCR.
f. PCR digitale
le colorant EvaGreen® est actuellement le seul colorant d’ADN de qPCR à être utilisé dans la PCR digitale par gouttelettes (ddPCR).[Dermott]
2. Tranquillité d’esprit plus performances de la PCR
L’EvaGreen® qPCR Master Mix est formulé pour les paramètres de PCR à cycle rapide, mais peut également être utilisé avec des protocoles de cycle réguliers. Cela vous permettra de vous assurer que vos réactions sont correctement configurées dès la première fois, et à chaque fois. De plus, plusieurs versions sont disponibles pour répondre à vos besoins : avec ou sans une référence interne ROX et un colorant de suivi pour éviter les erreurs de distribution des réactifs.
- Fast Plus EvaGreen® qPCR Master Mix contient le colorant EvaGreen® pour qPCR et l’ADN polymérase Cheetah™ Taq hotstart. Il convient à la qPCR utilisant un protocole à cycle rapide.
Fast Plus EvaGreen® qPCR Master Mix est un master mix 2X. Il est fourni avec un flacon séparé de colorant de référence ROX, pour une utilisation avec des instruments sans ROX, low ROX ou high ROX.
| Désignation | Fiche technique |
| Fast Plus EvaGreen® qPCR Master Mix – No ROX #31020 |
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| Fast Plus EvaGreen® qPCR Master Mix – Low ROX #31014 | – – – |
| Fast Plus EvaGreen® qPCR Master Mix – High ROX #31015 | – – – |
- 2X Forget-Me-Not™ EvaGreen® qPCR Master Mix.
Version améliorée avec une faible concentration d’un colorant de suivi bleu supplémentaire pour un contrôle visuel d’une distribution correcte.
Évite le gaspillage d’échantillons et d’autres erreurs coûteuses avec un mélange principal bleu clair Forget-Me-Not™.
Le Forget-Me-Not™ EvaGreen® qPCR Master Mix contient une faible concentration d’un colorant bleu inerte, ce qui permet à l’utilisateur de distinguer visuellement les puits contenant le mélange réactionnel des puits vides, et peut ainsi réduire les erreurs de pipetage, gagner du temps et des réactifs.
| Désignation |
| Forget-Me-Not™ EvaGreen® qPCR Master Mix – low ROX #31045 |
| Forget-Me-Not™ EvaGreen® qPCR Master Mix – high ROX #31046 |
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| Désignation | Fiche technique |
| Commandez la version 2 couleurs avec ROX #31042 | |
| Commandez la version 2 couleurs sans ROX #31041 | |
La qPCR fonctionne également dans les cellules vivantes !
En utilisant un colorant de viabilité (c’est-à-dire le monoazide de propidium, PMA ou PMAxx™), la qPCR peut détecter des cellules viables de manière sélectives[Knut Rudi]. Le colorant se lie à l’ADN de la cellule morte, et est lié de manière covalente après la photoactivation. L’application principale est la détection sensible de pathogènes bactériens[Zhao].
| Désignation | Fiche technique du FluoProbes PMA #BZ9340 |
| Commandez les Propidium MonoAzides (PMAs) | |
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Références :
Ohta T. et al., Ethidium bromide and SYBR Green I enhance the genotoxicity of UV-irradiation and chemical mutagens in E. coli, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 492:1–2, p.91-97 (2001)
McDermott, et al. Multiplexed target detection using DNA-binding dyechemistry in droplet digital PCR. Anal Chem 85, 11619-11627 (2013). 10.1021/ac403061n (EvaGreen multiplex in Biorad ddPCR)
Nowadly C. et al; Characterization of the Effects of Heat Stress on the DNA-Intercalating Dye EvaGreen for Potential Use With the Joint Biological Agent Identification and Diagnostic System Craig D. ; Mil Med. 179(6):626-32) (2014)
Knut Rudi et al., Use of Ethidium Monoazide and PCR in Combination for Quantification of Viable and Dead Cells in Complex Samples – Appl. Environ. Microbiol. vol. 71 no. 2 1018-1024 (2005)
Zhao L. et al., Improved quantitative detection of VBNC Vibrio parahaemolyticus using immunomagnetic separation and PMAxx-qPCR, Food Control, 110:106962 (2020)
EvaGreen Dye, Cheetah Taq and PMAxx are covered under US and international patents.
Forget-Me-Not, PMAxx, EvaGreen Dye and Cheetah Taq are trademarks of Biotium.
SYBR is a registered trademark of Thermo Fisher Scientific.
TaqMan is a registered trademark of Roche Molecular Systems.
